NK-92細(xì)胞，是從外周血單核細(xì)胞衍生來的、IL-2依賴型NK細(xì)胞株。

NK-92MI細(xì)胞，源自NK-92細(xì)胞的IL-2非依賴的NK細(xì)胞株。

親本細(xì)胞NK-92通過微粒體基因轉(zhuǎn)化法，用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

作為同源細(xì)胞，NK-92與NK-92MI細(xì)胞存在諸多共性，但二者在培養(yǎng)方式及注意事項(xiàng)上也不盡相同。

下面，小普將為同學(xué)們詳細(xì)闡釋，NK-92MI與NK-92細(xì)胞的收貨以及培養(yǎng)注意事項(xiàng)。

01

細(xì)胞收貨注意事項(xiàng)

除NK-92 細(xì)胞在分瓶后需添加IL-2之外，NK-92MI與NK-92細(xì)胞在收貨處理上，方法大致相同。具體操作如下：

細(xì)胞剛收到后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶先豎立靜置2~4個(gè)小時(shí)，讓細(xì)胞沉降到底部；

大細(xì)胞靜置完后，將瓶中上面部分培養(yǎng)基小心吸出，留底部細(xì)胞和3ml左右培養(yǎng)基在原瓶；

吸出的細(xì)胞培養(yǎng)基離心收集細(xì)胞沉淀，離心轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)3分鐘，或根據(jù)您的離心機(jī)實(shí)際情況而定，轉(zhuǎn)速不宜過高；

將得到的細(xì)胞沉淀，用2~3ml NK-92/NK-92MI完培重懸后，放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)過夜，一個(gè)T25最終培養(yǎng)體積是5~6毫升；

NK-92細(xì)胞可按照200 U/ml的濃度補(bǔ)加一點(diǎn)IL-2，因?yàn)樵苛舻呐囵B(yǎng)基IL-2可能已部分失效，NK-92MI細(xì)胞則不需要額外補(bǔ)加IL-2。

出廠的培養(yǎng)瓶為不透氣瓶蓋，一定要擰松到不掉的程度，使細(xì)胞充分透氣；

培養(yǎng)瓶橫放，瓶口擰松透氣，培養(yǎng)過夜；

第二天，視細(xì)胞密度和培養(yǎng)基消耗情況，進(jìn)行分瓶。不建議直接進(jìn)行離心操作，因?yàn)榻?jīng)過運(yùn)輸顛簸和各種處理，細(xì)胞很可能達(dá)不到狀態(tài)。盡量不要吹散細(xì)胞團(tuán)，加完液輕晃培養(yǎng)瓶即可。

02

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

NK-92MI與NK-92細(xì)胞同源，在培養(yǎng)方法上也有很多共同之處。但由于兩者對IL-2敏感程度不一，培養(yǎng)操作時(shí)略有差別。具體步驟如下：

NK-92與NK-92MI細(xì)胞都為懸浮生長，大部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞分散，并且細(xì)胞間隙會有較多的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片；

NK-92細(xì)胞對IL-2敏感。培養(yǎng)基中IL-2降解，將導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差。IL-2在-20℃解凍后置于4℃冰箱保存，4℃保存不應(yīng)超過兩周。配制好的新鮮培養(yǎng)基要盡快用完，建議每次使用前拿出來常溫預(yù)熱，不要放培養(yǎng)箱預(yù)熱，使用完畢后放回4℃冰箱保存；

實(shí)驗(yàn)室常備IL-2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不好、散在細(xì)胞變多、細(xì)胞不生長等情況，以200 U/ml的濃度添加IL-2，培養(yǎng)2-3天后即可恢復(fù)狀態(tài)；

NK-92MI細(xì)胞雖然對IL-2不敏感，正常培養(yǎng)不需要補(bǔ)加IL-2，但如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不太好，散在細(xì)胞變多，細(xì)胞不生長等情況，也可以以200U/ml的濃度補(bǔ)加IL-2，培養(yǎng)2-3天后狀態(tài)會有改善。

NK-92與NK-92MI細(xì)胞都對離心敏感。正常培養(yǎng)時(shí)，換液周期為2~3天，建議交替使用半量換液和離心換液法，即半量換液2~3次后，離心全量換液一次。盡量減少離心次數(shù)，細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞量少的時(shí)候，一般不建議離心；

換液方法：

? 補(bǔ)液法：每2~3天補(bǔ)加適量（根據(jù)培養(yǎng)容器和原來細(xì)胞懸液體積來定，T25瓶一次補(bǔ)液1~2毫升即可）新鮮培養(yǎng)基（NK-92需要同時(shí)補(bǔ)加200 U/ml IL-2，而NK-92MI則不需要），補(bǔ)加2-3次之后，離心全部換液。

? 半換液法：以T25瓶子（瓶中裝有5ml培養(yǎng)基）為例，豎起瓶子靜置一段時(shí)間（豎瓶前輕拍培瓶，讓輕貼底部的細(xì)胞團(tuán)浮起來），待細(xì)胞沉底（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況），小心吸出2.5ml上清轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000rpm 3~5min，離心后的細(xì)沉淀用2.5ml新鮮培養(yǎng)重懸后放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞生長時(shí)，聚集的細(xì)胞團(tuán)會逐漸增大，正常的細(xì)胞團(tuán)在顯微鏡下呈現(xiàn)白色透亮狀。若細(xì)胞聚集太多，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)中部發(fā)暗時(shí)，可傳代；

傳代方法：

? 將細(xì)胞團(tuán)用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可，吹打力度不可過大，否則會出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片），均分到兩個(gè)瓶子里，每瓶再補(bǔ)充等量培養(yǎng)基。

細(xì)胞對營養(yǎng)要求很高，千萬不能團(tuán)塊太大，這會導(dǎo)致營養(yǎng)不足；細(xì)胞團(tuán)塊過大時(shí)，需要稍微吹散，注意控制吹打次數(shù)，不需要全部吹散。

03

細(xì)胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比，NK-92細(xì)胞可適量補(bǔ)加IL-2，NK-92MI無需添加；

細(xì)胞凍存的時(shí)候，盡量吹散細(xì)胞，注意控制吹打力度。

04

細(xì)胞復(fù)蘇

NK-92MI與NK-92細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)方法相同，操作步驟如下：

復(fù)蘇后，用5ml新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞；

瓶子豎著（瓶蓋朝上）放進(jìn)培養(yǎng)箱，以增加細(xì)胞局部密度，瓶蓋保持透氣；

細(xì)胞生長需要穩(wěn)定的環(huán)境，可每天觀察1次，不要頻繁拿出培養(yǎng)箱觀察；

每3天補(bǔ)液一次，補(bǔ)充1-2ml新鮮培養(yǎng)基即可，補(bǔ)加1-2次之后半量換液，不要頻繁離心；

觀察到培養(yǎng)基明顯變黃，細(xì)胞團(tuán)塊明顯變大后可以分瓶，一次傳代最多分一瓶同等大小培養(yǎng)瓶。

05

 細(xì)胞團(tuán)塊是否需要吹散

減少離心次數(shù)，控制傳代時(shí)的吹打次數(shù)。團(tuán)塊需要吹散，但不用刻意吹散成單顆；

正常傳代或者離心換液后吹打，控制吹打次數(shù)以及力度，即使細(xì)胞都分散成單個(gè)，也會在1~2天內(nèi)聚集起來；

細(xì)胞團(tuán)太大時(shí)，需要分散；

細(xì)胞凍存的時(shí)候，細(xì)胞需要盡量分散，否則影響凍存效果。